ПОСТОЯННЫЙ КОМИТЕТ ПО КОНТРОЛЮ НАРКОТИКОВ
УТВЕРЖДЕНЫ
Постоянным
комитетом
по контролю
наркотиков
18 августа 1994
г.,
Протокол N
32
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
КРИМИНАЛИСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОПИЙНОГО И
МАСЛИЧНОГО MAKOB <*>
--------------------------------
<*> Разработчики:
А.В.Гаевский, Е.В.Коваленко (НПО
"ВИЛАР"),
В.Г.Савенко, Е.П.Семкин, В.И.Сорокин (ЭКЦ МВД РФ).
МЕТОДИКА ЭКСПЕРТНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Принцип химической диагностики
снотворного мака основан
на
обнаружении с помощью
тонкослойной хроматографии на силикагеле
алкалоидов
наркотолина, наркотина и ретикулина:
- при
наличии наркотолина либо при полном отсутствии наркотина
и
наркотолина образец относят к маку масличному;
- при
наличии значительного количества наркотина (более 15-20%
от
морфина) и полном отсутствии наркотолина образец относят к маку
опийному;
-
при наличии ретикулина образец относят к украинским сортам
масличного мака. (Этот
признак используется в
качестве
дополнительного.)
Для
обнаружения наркотолина,
ретикулина и других
фенольных
алкалоидов мака снотворного
авторами разработан способ проявления
хроматографических
пластинок раствором стабилизированной соли
диазония - прочного
синего Б, ранее
применявшийся только для
обнаружения каннабиноидов. Этот
способ существенно повышает
чувствительность и селективность анализа и в сочетании с реактивом
Драгендорфа позволяет
однозначно идентифицировать наркотолин
и
ретикулин
без применения эталонных веществ.
Правомочность применения
предлагаемого принципа химической
диагностики и его
методического решения подтверждена в процессе
серийной
оценки образцов мировой коллекции мака,
а также местных
форм из
различных районов страны.
Предлагаемая методика анализа образцов мака состоит из этапов:
экстракции алкалоидов хлороформом, количественного (или
полуколичественного)
определения морфина любым
общепринятым
методом и последующего обнаружения
сопутствующих морфину
алкалоидов (наркотолина, наркотина, ретикулина) с помощью
тонкослойной
хроматографии.
Перед
началом исследования необходимо выяснить,
относится ли
представленное на исследование растение к маку
снотворному. Для
этого
методом тонкослойной хроматографии определяют наличие в
исследуемом объекте морфина,
кодеина, тебаина. Наличие
этого
комплекса
признаков позволяет отнести растение к маку снотворному.
Подготовка проб для анализа.
Исследуемый объект измельчают до
размера частиц, проходящих
сквозь сито с отверстиями
диаметром
1 мм.
Влажную солому мака предварительно высушивают в сушильном
шкафу
(желательно с принудительной
вентиляцией) при температуре
50-60
град. C.
Затем
2 г
измельченной растительной массы
помещают в
коническую колбу вместимостью 200 мл с пришлифованной
пробкой,
приливают 5,0 мл
5% раствора карбоната
калия, тщательно
перемешивают до равномерного увлажнения и оставляют на 15 мин. для
набухания,
после чего приливают 100 мл хлороформа, колбу закрывают
пробкой и
в течение 30
мин. встряхивают на
качалке или
перемешивают магнитной мешалкой.
Прилипшие к стенкам
колбы
растительные частицы периодически погружают в раствор стеклянной
палочкой с
плоским концом. Полученный экстракт
фильтруют через
небольшой ватный фильтр
в плоскодонную колбу.
Первые 3-4 мл
фильтрата отбрасывают. Порцию
фильтрата объемом 20
мл, что
соответствует 0,4 г
сырья, переносят в маленькую круглодонную
колбу и
отгоняют растворитель досуха с
вакуумом при температуре
водяной бани 45-50 град. C.
Эту пробу используют для проведения
дифференциации: 40 мл
фильтрата используют для
количественного
определения морфина.
Методика определения. Перед началом
определения необходимо
установить
содержание морфина в растительном сырье. Для этого
можно применять любой из известных методов:
газохроматографический,
метод высокоэффективной жидкостной
хроматографии, метод полуколичественного определения морфина. С
этой целью
две порции хлороформного
экстракта из соломы
мака
объемом по 10
мл (что соответствует 0,2 г сырья) помещают в
круглодонные колбы и отгоняют растворитель досуха. Сухой остаток в
одной колбе растворяют в 5 мл метанола
(хлороформа), во второй - в
2,5 мл.
На
стартовую линию пластинки размером 10 x 10 см с нейтральным
слоем
силикагеля наносят приготовленные
растворы в количествах,
указанных в табл.
1. Диаметр пятен на старте при нанесении не
должен
превышать 3 мм. Для каждого
разведения наносят не
менее
двух серий
пятен. После полного
высыхания пятен пластинку
хроматографируют в смеси растворителей толуол - ацетон - этанол -
аммиак (25%) (45:45:6:2), затем высушивают под
тягой в течение
30-40
мин. до полного исчезновения запаха
аммиака. Пластинку
опрыскивают реактивом Драгендорфа
и отмечают минимальные объемы
нанесенных
на пластинку проб, при которых четко
проявляются пятна
морфина. По табл. 1 находят соответствующее содержание морфина
в
образце (в
процентах).
Таблица
1
Содержание морфина в растительном сырье в зависимости
от объема нанесенного экстракта
------------------------------------------------------------------
|Количество раствора на пластинке,|Содержание морфина в сырье, % |
| мкл | |
|---------------------------------+------------------------------|
|Разведение 5 мл
| |
| 2,5 |
1,00 |
| 3,0 | 0,80 |
| 3,5 |
0,70 |
| 4,0 |
0,60 |
| 4,5 |
0,55 |
| 5,0 | 0,50 |
|---------------------------------+------------------------------|
|Разведение 2,5 мл
| |
| 2,5 |
0,50 |
| 3,0 |
0,40 |
| 3,5 | 0,35 |
| 4,0 |
0,30 |
| 5,0 |
0,25 |
| 6,0 |
0,20 |
| 8,0 |
0,15 |
| 12,0 |
0,10 |
------------------------------------------------------------------
Если
при различном разведении пробы или разных повторностях на
пластинках
будут получены разные показатели содержания
морфина в
образце,
результаты усредняют.
После
получения показателей содержания морфина пробу,
предназначенную для
обнаружения наркотина, наркотолина и
ретикулина, растворяют в
различных объемах смеси
метанола с
хлороформом (3:1) либо в
чистом хлороформе. Объем
растворителя
выбирается в зависимости
от содержания морфина
в испытуемом
образце
(табл. 2). Полученные растворы наносят
на пластинки в
количестве, указанном в той же таблице.
Таблица
2
Объем пробы, необходимой для нанесения на
хроматографическую пластину, в зависимости
от содержания морфина в растительном сырье
------------------------------------------------------------------
|
Содержание |
Объем |
| морфина
|---------------------------------------------------|
|в
образце, %|для растворения сухого |для нанесения на пластинку,|
| | остатка, мл
|мкл |
| |-----------------------+---------------------------|
| |наркотолин,| ретикулин
|наркотолин,| ретикулин |
| |наркотин |
|наркотин | |
|------------+-----------+-----------+-----------+---------------|
| 0,1
| 1,0 | 0,5 |
8,8 | 12,0
|
| 0,15
| | | 5,8 | 9,0
|
|------------+-----------+-----------+-----------+---------------|
| 0,20
| 2,0 | 1,0 |
8,8 | 12,0
|
| 0,25
| | | 7,0 | 10,0
|
| 0,30
| | | 5,8 | 9,0
|
|------------+-----------+-----------+-----------+---------------|
| 0,35
| 4,0 | 2,0 | 10,0 | 15,0
|
| 0,40
| | | 8,8 | 12,0
|
| 0,45
| | | 7,8 | 11,0
|
| 0,50
| | | 7,7 | 11,0
|
|------------+-----------+-----------+-----------+---------------|
| 0,55
| 6,0 | 3,0 |
9,6 | 15,0
|
| 0,60
| | | 8,8 | 12,0
|
| 0,65
| | | 8,1 | 12,0
|
| 0,70
| | | 7,5 | 11,0
|
| 0,75
| | | 7,0 | 10,5
|
| 0,80
| | | 6,0 | 9,0
|
------------------------------------------------------------------
Объем
пробы и разведение выбраны
с таким расчетом,
чтобы
наркотин
проявлялся только при содержании более 20% от морфина.
Для
обнаружения наркотолина и
наркотина на стартовую
линию
хроматографической
пластинки с нейтральным
слоем силикагеля
наносят
три порции исследуемого
извлечения, а также
0,01 мл
раствора стандартных образцов
алкалоидов, как указано на схеме
(рис. 1).
Рис. 1. Хроматограмма экстракта маковой соломы
-------------------------
|
| | () () | 6
|
| | () () | 5
| ()
| () | () | 4
|
| | |
|
| | () () | 3
|
| | |
|
| | () () | 2
|
| | |
| () () | () () | () () | 1
|-()----+-()----+-()----|
| а
б | в г | д е |
-------------------------
Система толуол - ацетон - этанол - аммиак (25%) (45:45:6:2).
Пластинки многоразовые
полимерные
"Сорбил" или стеклянные
производства различных фирм: 1 - морфин, 2 - кодеин, 3 - тебаин, 4
-
наркотолин, 5 - папаверин, 6 - наркотин; а, в, д - испытуемые
растворы;
б, г, е - растворы стандартных образцов.
Пятна
подсушивают в токе холодного воздуха,
после чего
пластинку хроматографируют восходящим способом в системе
растворителей толуол - ацетон - этанол - аммиак (25%) (45:45:6:2).
После прохождения фронта растворителя до конца
пластинки ее сушат
под тягой
в течение 20 мин., закрывают
стеклом зону "д-е", а
оставшуюся часть опрыскивают
свежеприготовленным 0,1% водным
раствором прочного синего
Б. Все проявленные пятна обводят
карандашом и немедленно
записывают их окраску.
Через 15 мин.
отмечают
возможные изменения окраски пятен, закрывают стеклом зону
"а-б", зону "д-е" открывают и опрыскивают пластинку
концентрированным реактивом
Драгендорфа. Все проявленные
пятна
обводят карандашом и
фиксируют изменение окраски
пятен ранее
обнаруженных веществ. На хроматограммах "а" и "в"
могут проявиться
пятна
наркотолина с величиной Rf, около 0,64.
Окраска наркотолина
с прочным
синим Б вначале фиолетовая, а после проявления реактивом
Драгендорфа - синяя.
Остальные пятна на хроматограмме "в" после
проявления реактивом Драгендорфа сливаются с фоном.
На
хроматограмме
"д" небольшое пятно
наркотолина располагается
непосредственно под пятном
папаверина. Наличие четкого
пятна
наркотолина
позволяет отнести объект к масличному маку.
Если
наркотолин в образце не найден, то
отмечают присутствие
наркотина. Если наркотин в пробе не обнаружен, объект относят к
масличному
маку.
При
четком обнаружении наркотина и полном отсутствии
наркотолина образец относят к опийному маку.
Обнаружение ретикулина
(проводится для отнесения
образца к
украинским сортам мака
масличного, если в
этом есть
необходимость).
На
пластинку с нейтральным слоем сорбента наносят
две порции
извлечения, пятна подсушивают в токе холодного воздуха, а затем
хромотографируют в системе хлороформ - изопропанол - аммиак (25%)
(30:10:0,8). После окончания хроматографирования пластинку сушат в
течение 30
мин., хроматограммы зоны "а-б" закрывают стеклом и
опрыскивают 0,5% спиртовым раствором едкого натра, а затем 0,1%
спиртовым
раствором прочного синего Б. Затем
стеклом закрывают
хроматограммы зоны "в-г", хроматограммы зоны
"а-б" открывают и
опрыскивают пластинку реактивом
Драгендорфа. Зона ретикулина
располагается между зонами морфина и кодеина. Остальные алкалоиды
выходят
выше кодеина (рис. 2).
Рис. 2. Хроматограмма экстракта маковой соломы
---------------------------
| () () | |}
| () () | |}
| () | |} 4
| () | |}
| | |
| () () | |
3
| | |
| () | () |
2
| | |
| () () | ()
() | 1
|---()-------+---()-------|
| а б | в
г |
---------------------------
Система хлороформ - изопропанол -
аммиак (25%) (30:10:0,8).
Пластинки
многоразовые, стеклянные производства
различных фирм: 1
- морфин,
2 - ретикулин, 3 - кодеин, 4 - остальные алкалоиды опия;
а, в -
испытуемые растворы; б, г - растворы стандартных образцов.
Следует отметить, что для
хроматографирования согласно
вышеизложенной методике должны применяться пластины, не содержащие
в качестве
связующего крахмал, т.е. не темнеющие
при опрыскивании
реактивом
Драгендорфа. Этим условиям отвечают стеклянные пластины,
производимые в Эстонии,
пластины Merck 60 и 25 и отечественные
пластинки
"Сорбфил" на стеклянной или полимерной основе.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И ФОРМИРОВАНИЕ ВЫВОДОВ
С
целью полного расследования и правильной квалификации
правонарушений,
связанных с посевом
и выращиванием
наркотикосодержащих растений, на
разрешение экспертизы ставится
вопрос: к какому
виду относится произраставшее на участке
(указывается место изъятия)
растение и является
ли оно
наркотикосодержащим?
Для
полного ответа на вопрос в
отношении растений рода
мак
необходимо
выявить анатомо - морфологические признаки растения мак
(наличие и
особенности стебля, листьев,
коробочек, наружную и
внутреннюю
эпидерму, части сосудистопроводящей системы,
млечники,
пыльцевые зерна и
т.п.), наличие основных
алкалоидов опия:
морфина, кодеина и
тебаина (содержание морфина
и кодеина
превалирует над содержанием
тебаина). На этом
этапе эксперт
устанавливает принадлежность растений к снотворному маку. Далее
необходимо
оценить содержание двух алкалоидов
- наркотолина и
наркотина.
При этом возможны три варианта:
-
наличие в растительном
объекте наркотолина служит
достаточным основанием для вывода:
представленное на исследование
растение
является маком масличным;
-
при отсутствии на
хроматограмме зоны наркотолина обращают
внимание
на зону наркотина: если в растительном
объекте наркотин
присутствует (при указанных
условиях разведения), то делается
вывод: представленное на исследование растение является маком
опийным;
- при
отсутствии на хроматограмме как зоны наркотолина, так и
зоны
наркотина растение также относят к маку масличному.
Наличие
в растительном объекте алкалоида
ретикулина является
дополнительным признаком принадлежности данного растительного
объекта к
маку масличному.
Следует иметь в виду также, что
сырье, длительно хранившееся
во влажном
состоянии, может резко
отличаться по компонентному
составу от сырья,
свежесобранного или высушенного в оптимальных
условиях. Поэтому растительное
сырье, имеющее признаки загнивания
(побурение, плесень и
т.д.), использовать для
проведения
исследования
нельзя.
Приготовление раствора
стандартных образцов алкалоидов 0,05 г
морфина - основания,
0,025 г кодеина
- основания, 0,01
г
папаверина и 0,01 г наркотина
растворяют в 25 мл смеси метанола с
хлороформом в соотношении 3:1.
Приготовление реактива Драгендорфа
Раствор 1: 0,85 г нитрата висмута основного растворяют в 40 мл
воды и 10
мл уксусной кислоты.
Раствор 2: 20 г
йодида калия растворяют
в 50 мл воды.
Смешивают равные объемы растворов
1 и 2. К 40 мл смеси добавляют
30 мл
уксусной кислоты и 100 мл воды.